1928年3月参加平江农民扑城暴动，周桂生自告奋勇参加敢死队，用炸药包炸毁敌军火力点，为扑城农军打开了一条通道。4月加入中国共产党。1928年7月24日，平江起义部队领导人和中共平江县委召开群众大会，宣布成立工农红军第五军和平江县工农兵苏维埃政府。周桂生参加了成立大会，毅然报名参加红五军，12月随部队到井冈山。

　　1930年在红5军任排长，参加两次攻打长沙战斗。攻克长沙后，周桂生负责宣传工作。后任红16军7师连长、营长，红16师团长，参加中央苏区、湘鄂赣苏区反“围剿”。

　　1940年12月底，新四军老三团、新三团奉命合编为新四军第二支队，周桂生任司令员。1941年1月，国民党顽固派制造皖南事变，新四军皖南部队遭到包围，新四军决定，除军直机关部队外，编成3个纵队，周桂生任第二纵队司令员，率第二纵队为中央纵队，掩护军直属队及教导总队突围。

　　为了保护军首长的安全，周桂生亲临前沿阵地指挥作战。13日黄昏，率部转移至狮形山西北高地时，遭遇敌人重兵围攻。激战中，周桂生身上多处中弹，仍端枪冲向敌人，掩护战友突围，最终壮烈牺牲，时年35岁。